叶酸在新鲜绿叶蔬菜中含量最多，肝、肾、酵母和蘑菇中也较多。食物烹调、腌制及储存过久等均可被破坏，尤其是加水煮沸，损失量尤大。食物中的叶酸要经过胆汁和小肠中的γ-谷氨基羧肽酶（γ-glutamyl carboxypeptidase）水解成蝶酰单谷氨酸和二谷氨酸始能吸收，吸收部位主要在近端空肠。吸收的叶酸，以N5-甲基四氢叶酸的形式存在于血中，和白蛋白疏松结合运输，通过叶酸受体被摄取进入细胞内，在维生素B12依赖的蛋氨酸合成酶作用下形成四氢叶酸而发挥作用；亦可再度成为多谷氨酸盐储存，后者可避免叶酸逸出细胞外。成人每日需叶酸50～200μg，储存于肝细胞内，储存量仅5～10mg，因此营养性巨幼细胞主要由叶酸缺乏引起。

四氢叶酸是体内转移"一碳基团"，包括甲基（-CH3）、甲酰基（-CHO）、甲烯基（-CH2）、次甲基（-CH）及羟甲基（-CH2OH）等的过程中起辅酶作用。丝氨酸是一碳基团的来源，它和四氢叶酸作用形成N5.10-甲烯基四氢叶酸和甘氨酸；另一来源系在组氨酸分解代谢中的亚氨甲酰谷氨酸和四氢叶酸作用生成N5-亚氨甲酰四氢叶酸和谷氨酸。这些辅酶型叶酸携带各种一碳基团从而参与体内一些重要生化反应：如参与胸腺嘧啶核苷酸和嘌呤的合成，尿嘧啶脱氧核苷酸（dUMP）和N5.10-甲烯基四氢叶酸形成胸腺嘧啶核苷酸（dTMP）和二氢叶酸。